scRNA in R (1)

发表于2023-03-27更新于2023-03-27

这里是单细胞转录组R语言分析合集第一弹，用于整理和记录单细胞RNA转录组的分析方法框架，目前可能不会涉及到太多代码的部分，只是整理框架，用于给自己一个备忘查找的方案~

本篇为基础流程方案。基础流程即包括常见的从下游数据到降维聚类，细胞注释方案，对R中单细胞对象的操作，以及这一过程中”至少”需要展示的result figure

  1. 数据对象化，读入单样本/多样本的原始数据，merge后，将单细胞上游数据获取的表达转化为seurat对象或者anndata，以rds/h5ad的形式保存，不再采用其他多种格式例如SngleCellExperiment等；如果需要多种对象之间的转换，可用seurat_wrapper或者sceasy进行转换。原始数据在这一步结束后，以scRNA_raw.Rdata/rds的形式留存待用；
  2. QC，主要针对双细胞、线粒体基因、核糖体基因、血红蛋白（针对PBMC）、低表达基因、细胞周期等进行过滤，必要时可进行基因表达的插补，注意只有10X系列数据可以插补，同时需考虑时间和计算开销；
  3. 数据标准化和缩放，目前已经有SCTransform流程，但是因为很多工具还需要方便地提取log后数据的问题。主干分析流程不采用SCTransform，仍然使用log+scale；如需使用CCA进行整合则改为SCTransform，但仍需另配log+Scale。
  4. 线性降维和非线性降维、PC数挑选、聚类，最佳resolution选择，最终得到基础的降维聚类，在极大数量单细胞时，tsne也有很好的表现，因此主干中使用tsne和umap同时进行降维；
  5. 【如果需要】多样本去批次，对于merge的数据，使用harmony、CCA、RPCA(Seurat新出的，原理跟harmony相似)、liger(跨物种整合)，fastMNN(快速整合)等，进行数据整合和批次效应去除，这部分细节和可调整空间很多，注意在处理批次之前，对单细胞的barcode进行处理，否则会出现duplicate id的问题；
  6. 差异基因分析，基于细胞注释、样本或其他条件进行差异分析，可用FindConservedMarkers、FindAllmarkers、COSG、Scibet等进行差异分析，这一步涉及到下面的细胞注释，因此通常这里只返回阳性的marker(only.pos =T)，当然，实现上可以考虑增加一个+/- marker都返回的结果；
  7. 执行细胞注释，基于参考数据的scCATCH、SingleR，基于projection of reference data的Seurat等，基于参考分类器的garnett，以及基于marker的手动注释、富集注释和cellasign、cellid，注意两个最重要的细胞marker库：panglaodb和cellmarker，以及目前比较好的网页工具toppgene和最新出来的Cell Taxonomy。
  8. 基本流程的可视化内容，可用工具包括SCpubr、scRNAtoolVis和Scillus
    1. DimPlot绘制降维图，可取不同的reduction，包括PCA、UMAP、tsne和PHATE
    2. FeaturePlot在降维上直接绘制基因表达的结果，使用基础的FeaturePlot或者Nebulosa plots；
    3. 小提琴图，使用Vlnplot绘制QC结果，VlnPlot绘制marker基因在不同cluster里的表达
    4. dotplot，绘制不同的基因在不同cluster里的表达
    5. barplot，使用barplot绘制不同细胞类型在不同样本/条件里的丰度
    6. volcano plot，使用火山图绘制多细胞里的差异基因
    7. heatmap，绘制特定基因在不同细胞、组别内的mean expression，并添加注释信息